菌落PCR出現(xiàn)假陽(yáng)性的原因：可能使用了錯(cuò)誤的PCR鑒定引物、樣品間交叉污染、PCR試劑的污染、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的污染、氣溶膠污染以及實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染。
1.使用了錯(cuò)誤的PCR鑒定引物：
在進(jìn)行菌液PCR時(shí)，如果使用了基因特異引物，可能會(huì)從游離的目的片段DNA上擴(kuò)增出條帶，而不是從重組質(zhì)粒上，導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。推薦使用一對(duì)載體通用引物進(jìn)行菌液PCR鑒定，以減少假陽(yáng)性的發(fā)生。
2. 樣品間交叉污染：
樣品污染可能由于收集樣本的容器被污染、樣本放置時(shí)密封不嚴(yán)溢于容器外、容器外粘有樣本而造成相互間交叉污染。此外，樣本核酸模板在提取過(guò)程中，由于吸樣槍污染也可能導(dǎo)致標(biāo)本間污染。
3.PCR試劑的污染：
在PCR試劑配制過(guò)程中，加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染，也是造成假陽(yáng)性的原因。
4.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的污染：
PCR反應(yīng)中主要常見(jiàn)的污染問(wèn)題是PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染。微量的PCR產(chǎn)物污染就可形成假陽(yáng)性。
5.氣溶膠污染：
在空氣與液體面摩擦?xí)r可形成氣溶膠，劇烈地?fù)u動(dòng)反應(yīng)管、開(kāi)蓋時(shí)、吸樣時(shí)及污染進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染。一個(gè)氣溶膠顆粒可含48000拷貝，因而由其造成的污染是一個(gè)值得特別重視的問(wèn)題。
6.實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染：
由于克隆質(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)高，且在純化過(guò)程中需用較多的用具及試劑，活細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒具有很強(qiáng)的生命力，其污染可能性也很大，這也是造成假陽(yáng)性的一個(gè)重要原因。
為了避免假陽(yáng)性的出現(xiàn)，應(yīng)采取適當(dāng)?shù)拇胧p少上述各種污染的可能性，如使用正確的PCR鑒定引物、嚴(yán)格操作規(guī)范、避免交叉污染等。
客服一
