MTT分析法
原理：活細胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶于水的藍紫色產(chǎn)物(formazan)，并沉淀在細胞中，而死細胞沒有這種功能。二甲亞砜(DMSO)能溶解沉積在細胞中藍紫色結(jié)晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。再用酶標儀測定OD值。
實驗材料：細胞樣品試劑、試劑盒：PBSDMSO胰蛋白酶甘氨酸緩沖液儀器、耗材：加樣器96孔培養(yǎng)板酶聯(lián)免疫檢測儀培養(yǎng)板
具體操作：普通MTT法1、接種細胞：用含10％胎小牛血清得培養(yǎng)液配成單個細胞懸液，以每孔1000-10000個細胞接種到96孔板，每孔體積200ul。2、培養(yǎng)細胞：同一般培養(yǎng)條件，培養(yǎng)3-5天(可根據(jù)試驗目的和要求決定培養(yǎng)時間)。3、呈色：培養(yǎng)3-5天后，每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS配制，pH=7.4)20ul.繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，對于懸浮細胞需要離心后再吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加150ulDMSO，脫色搖床振蕩10min，使結(jié)晶物充分融解。4、比色：選擇490nm(570nm)波長，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上測定各孔光吸收值，記錄結(jié)果，以時間為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線。
藥物MTT法貼壁細胞：1、收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，每孔加入100ul,鋪板使待測細胞調(diào)密度1000-10000孔，(邊緣孔用無菌PBS填充)。2、5%CO2，37℃孵育，至細胞貼壁，加入濃度梯度的藥物,原則上，細胞貼壁后即可加藥，或兩小時，或半天時間，一般是前一天下午鋪板，次日上午加藥。一般5-7個梯度,每孔100ul,設(shè)3-5個復孔.建議設(shè)5個，否則難以反應(yīng)真實況。3、5%CO2，37℃孵育24-72小時，倒置顯微鏡下觀察。4、每孔加入20ulMTT溶液(5mg/ml，即0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4h。若藥物與MTT能夠反應(yīng)，可先離心后棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2-3遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液。5、終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。6、每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm(570nm)處測量各孔的吸光值。7、同時設(shè)置調(diào)零孔即空白組(培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜)，對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜)。
懸浮細胞：1、收集對數(shù)期細胞，調(diào)節(jié)細胞懸液濃度1×106/ml，按次序?qū)ⅱ傺a足的1640(無血清)培養(yǎng)基40ul；②加ActinomycinD(有毒性)10ul用培養(yǎng)液稀釋(儲存液100mg/ml，需預試尋找*稀釋度，1:10-1:20)；③需檢測物10ul；④細胞懸液50ul(即5×104cell/孔)，共100ul加入到96孔板(邊緣孔用無菌水填充)。每板設(shè)對照(加100ml1640)。2、置37℃，5%CO2孵育16-48小時，倒置顯微鏡下觀察。3、每孔加入10ulMTT溶液(5mg/ml，即0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4h。(懸浮細胞推薦使用WST-1，培養(yǎng)4h后可跳過步驟4)，直接酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm(630nm校準)測量各孔的吸光值)離心(1000轉(zhuǎn)x10min)，小心吸掉上清，每孔加入100ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm(630nm校準)測量各孔的吸光值。同時設(shè)置調(diào)零孔(培養(yǎng)基、MTT、二甲基亞砜)，對照孔(細胞、相同濃度的藥物溶解介質(zhì)、培養(yǎng)液、MTT、二甲基亞砜)，每組設(shè)定3復孔。
注意事項：1、選擇適當?shù)眉毎臃N濃度。
2、避免血清干擾：一般選小于10％的胎牛血清的培養(yǎng)液進行試驗。在呈色后盡量吸盡孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液。
3、設(shè)空白對照：與試驗平行不加細胞只加培養(yǎng)液的空白對照。其他試驗步驟保持一致，*后比色以空白調(diào)零。
4、MTT實驗吸光度*后要在0-0.7之間，超出這個范圍就不是直線關(guān)系，IC50是半抑制率，意思是抑制率50％的時候藥物的濃度。把藥品稀釋成不同的濃度，然后計算各自的抑制率，以藥品的濃度為橫坐標，抑制率為縱坐標作圖，然后得到50％抑制率時候的藥品濃度，就是IC50。要點：藥品2倍稀釋，多做梯度，做點線圖即可！
5、吹打時懸液總量不能太多，達到吸管吸液量的3-4倍，可能比較容易混勻。10ml的離心管里面裝3-4ml的懸液：懸液太少容易吹起很多氣泡，懸液太多又不容易吹成單細胞懸液。
6、吸管的吸液量在1ml左右：吸液量過多，一下吸起很多液體，管中所剩就很少，這樣吹打容易起泡，吸液量過少，吹打的力度就不夠，吹打就會不均勻。如果是吸液量1ml多的吸管，總液量在5ml左右為益。
7、吸的時候要在懸液底部，然后提起來一點，但是吹下去的時候不要離開液面，否則容易吹打出氣泡。
8、吹打次數(shù)100左右，就可以吹打均勻了。
9、向每孔中用槍頭加入細胞時不要太快，否則會使細胞聚積在底部。
上海遠慕生物主營產(chǎn)品有elisa試劑盒、染色液、層析色譜填料、血清、標準品等，價格實惠，質(zhì)量有保證，如需訂購，可與我司銷售聯(lián)系。
注：本公司產(chǎn)品僅供科研使用！
原創(chuàng)作者：上海遠慕生物科技有限公司
客服一
